1、加样

　　对于间接ELISA试剂盒标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。

　　2、洗涤

　　在ELISA试剂盒中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

　　3、 温育

　　每种试剂都有其合适的反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。

　　4、酶标仪判读

　　作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，一般使用双波长，一个检测波长，一个参比波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外，在用酶标仪读数时一般先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书

　　由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前上以及我国有了部分标准血清或参比血清（血清盘）。但由于受方法学及技术条件的限制，在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性，但我们可以通过以上措施把非特异性显色降至低限底，从而提高检测的特异性，并得到更准确、可靠的实验结果。