大鼠石胆酸(LCA）ELISA试剂盒技术指导

本试剂仅供研究使用  

目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中血浆石胆酸(LCA）的含量。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被血浆石胆酸(LCA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在血浆石胆酸(LCA）的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血浆石胆酸(LCA）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度.

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

注意事项：

1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4.请每次测定的同时做标准曲线，建议做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔di一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6.底物请避光保存。

7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9.本试剂不同批号组分不得混用。

10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，    

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD      

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释      

倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标      

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值      

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释      

倍数，即为样品的实际浓度。                  

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存： 2-8℃。

2．有效期： 6个月