孔雀石绿ELISA试剂盒操作说明

（酶联免疫法）

 1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测测样本中的孔雀石绿。（ MalachiteGreen oxalate ，MG)，试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的孔雀石绿和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗孔雀石绿抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含孔雀石绿含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中孔雀石绿的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.025ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃， 30min～30min～15min

2.3 检测下限：

鱼/虾…………………………0.1ppb

2.4 交叉反应率：

 2.5 样本回收率：

鱼/虾等水产品、水样……………85%±15%

3 试剂盒组成                                                                                                                

酶标板………………………………96孔

高浓度标准品溶液1瓶（1ml/瓶）：10ppb（高标准液有挥发性，需注意密封）

标准品溶液0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb（均为空瓶子，现配现用）。

酶标记物（红盖）…………………11ml

抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

助溶剂（黄盖）………………………6ml

氧化剂（黑盖）………………………6ml

10X复溶液（黄盖）…………………20ml

20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

说明书………………………………1份

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒温箱

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯、甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：1×样品复溶液

以100 ml为例，取10 ml 10×复溶液加入50ml去离子水和40ml甲醇，充分混匀。

配液2：1×工作洗涤液

将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 鱼、虾

1）取匀质无骨的样品1 g，加入50 ml离心管中，加入0.3 ml 乙腈、6 ml乙酸乙酯，充分震荡（不少于5分钟，确保鱼肉没有结块）；

2）室温下4000r/min 离心10min，取上清液3 ml加入10ml玻璃试管中，再加入氧化剂50 ul，震荡2分钟；

3）每管加入助溶剂50 ul(不振荡)，50℃水浴环境下氮气吹干（吹完之后管底部应该有一滴液状物，当样本含油脂过高时，此时可见试管底部残留有黄色粘稠状液滴）；

4）加入1 ml 1×样品复溶液，溶解混匀，取50ul用于分析。

    样本稀释倍数：2     检测下限：0.1ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需配制标准品应用液；低浓度的标准品不稳定，需现配现用（配好的标品在4℃可稳定1个月）。

在0ppb的瓶中加1×样品复溶液3ml，0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb的瓶中分别加1×样品复溶液1.5ml，0.4ppb的瓶中加1×样品复溶液2.88ml。

标准液6：取10ppb高浓度标准品溶液120ul加入装有2.88ml 1×样品复溶液的0.4ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.4ppb。

标准液5：取1.5ml标准液6加入装有1.5ml 1×样品复溶液的0.2ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.2ppb。

标准液4：取1.5ml标准液5加入装有1.5ml 1×样品复溶液0.1ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.1ppb。

标准液3：取1.5ml标准液4加入装有1.5ml 1×样品复溶液的0.05ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.05ppb。

标准液2：取1.5ml标准液3加入装有1.5ml 1×样品复溶液的0.025ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.025ppb。

标准液1：直接使用1×样品复溶液，浓度即为0ppb。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。

6.3 洗    涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。

6.5 洗    涤：同上

6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.7 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以di一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。